酶脱除玉米赤霉烯酮影响有哪些？磁性固定化辣根过氧化物对其降解

　　文|谈史录

　　编辑|谈史录

　　«——【·引言·】——»

　　玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种著名的F2毒素，由镰刀菌产生，主要污染玉米、小麦、大麦、燕麦等谷物及其制品，是世界上分布最广泛的霉菌毒素之一。

　　它不仅会影响食品安全，甚至能够在食物链中积累，对动物甚至人类造成严重伤害。

　　目前ZEN的脱除方法主要有物理、化学和生物法，以削除或削弱其中毒性，然而物理和化学方法具有选择性弱、成本高、不可回收等缺点。

　　只有生物酶法由于具有低毒、高效的优点，因此过氧化物酶如辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的氧化降解被认为是一种潜在环保的方法。

　　辣根过氧化物酶是一种血红素酶，具有易得和高比活性的优点，在过氧化氢作用下，能够催化氧化多种化合物，如芳香胺化合物、酚类化合物、吲哚类和有毒物质的催化氧化。

　　磁性纳米粒子在长期使用过程中可能会发生聚集或沉淀，可以通过修饰表面的化学基团的方法来提高其生物相容性和化学稳定性。

　　一种有效的方法是用亲水聚合物，如聚丙烯酸、聚酰胺酸和超支链聚甘油（HPG）改性到纳米粒子表面。

　　利用单因素实验确定反应温度、溶液pH值、过氧化氢浓度、反应时间等最佳条件，为连续性去除ZEN提供理论依据。

　　«——【·酶学特性的分析·】——»

　　将Fe3O4-SiO2进行HPG活化，具体步骤如下：将0.1gFe3O4-SiO2加入30μLCH3OK和2.5mL二甲基酰胺溶液中。

　　在50℃，100r/min条件下搅拌反应1h，加入10mL无水二氧六环，于95℃反应，然后缓慢向溶液中滴加2.0g缩水甘油，并将混合物保持搅拌4h。

　　加入甲醇分散，利用磁铁分离，用甲醇反复冲洗，得到的固体颗粒在真空烘箱中干燥12h。

　　接着用琥珀酸酐修饰Fe3O4-SiO2-HPG，将0.1gFe3O4-SiO2-HPG加入100mg三乙胺和10mL二甲基甲酰胺混合溶液中，加入70mL丁二酸酐，将该混合体系在氮气气氛及黑暗中搅拌5h。

　　通过施加外部磁铁收集产物，并用甲醇冲洗3次。固体物质在真空干燥箱中干燥12h。

　　将上述制备好的载体在50mLPBS缓冲溶液（100mmol/L）中浸泡24h，磁分离后，缓慢加入25mg/mL的EDC，在温度50℃，转速为100r/min的条件下搅拌2h。

　　再加入400U/mLHRP溶液，随后以50r/min的转速在45℃下搅拌，反应5h后，利用磁铁分离收集纳米颗粒。

　　用磷酸盐缓冲溶液洗涤固定化HRP除去未结合的酶，得到的固定化酶在4℃条件下贮藏备用。

　　验证载体表征可取适量样品粉末，经过冻干后分散在导电胶上，经过真空条件对样品进行镀金处理，进行扫描电镜观察磁性样品固定化前、后的形貌变化。

　　使用蒸馏水洗涤样品，放在55℃真空干燥箱中干燥至恒重，使用研钵将干燥后的200mgKBr粉末和2mg上述制备的样品（200℃下脱水处理24h）混合研磨均匀。

　　在10kPa的压力下将其制成1mm厚，直径为13mm的透明薄片，使用红外光谱仪在室温（25℃）条件下，于400～4000cm-1波长范围内扫描32次收集样品光谱信息。

　　进行X-射线衍射分析（XRD）要先将样品在55℃真空烘干至恒重，研磨100mg样品制成粉末后压成平面。

　　X射线衍射仪在Cu靶，Ni滤波，Si-Li探测器，40kV×40mA，扫描范围：15～80°，扫描速度：2°/min，测试制得的磁性载体和磁酶颗粒内分子排列结构。

　　粒径分析可取适量上述制备的样品放在容器中，使用乙醇作为分散剂，超声10min进行分散，将分散均匀的样品放入激光衍射仪中进行检测。

　　磁性能方面可以将上述制备的磁性载体和磁性固定化酶以比饱和磁化强度作为磁强度检测的指标，分析样品的磁性能。

　　热封住一段7mm带棉签的塑料管的一端，将样品压实在其中，用棉花将另一端塞住，通过振荡样品磁强计进行测定。

　　测定辣根过氧化物酶的催化活性，并计算酶的相对活性，用紫外可见分光光度计在波长510nm处测定酶活性。

　　一个酶活力单位表示为：30℃时1min催化氧化1μmol愈创木酚所消耗的酶量。

　　酶学特性的使用了不同温度和pH值条件下游离酶和固定化酶活性的差异，以温度为影响因素，在最适pH值的条件下，将游离酶和固定化酶分别在不同温度下（20，30，40，50，60℃）贮藏1h。

　　溶剂为磷酸盐缓冲溶液（100mmol/L，pH7.0），得到了不同温度下酶活性的效应曲线。

　　以pH值为影响因素，在最适温度下，在不同pH值（4~8）的磷酸盐缓冲液（100mmol/L）中进行酶活性试验，得到不同pH值下酶活性的效应曲线。

　　ZEN的单因素实验首先用乙腈制备质量浓度为500μg/mL的ZEN作为储备溶液，然后用乙腈梯度稀释至一定浓度，在-20℃避光保存。

　　为实现ZEN的高效降解，对反应条件（反应温度、溶液pH值、过氧化氢浓度、反应时间）进行优化。

　　具体操作如下：将磷酸盐缓冲液（100mmol/L）、水和一定浓度的过氧化氢组成模型溶液。

　　将ZEN标准溶液在氮气气氛中蒸发溶剂，然后与模型溶液涡旋搅拌30s并超声3min使其完全溶解，搅拌后加入0.6U/mL的固定化酶。

　　将模型溶液置于TQZ-312型恒温振荡培养箱中，在150r/min的轨道搅拌下反应，分别选取反应温度25，30，35，40，45℃。

　　过氧化氢浓度13，26，39，52，65mmol/L，溶液pH值4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，反应时间0，30，60，90，120，150，210，320，480，1440min，研究对ZEN降解率的影响。

　　反应结束后通过磁铁分离固定化酶来终止反应，用0.5mL氯仿加入到1mL样品中，并涡旋搅拌2min，用氯仿重复萃取3次，每次收集有机相。

　　然后超声20min，将样品中的氯仿用氮吹仪吹干，并用1mL乙腈复溶，经过0.45μm有机滤膜过滤，溶液通过高效液相色谱荧光检测器（HPLCFL）进行检测和定量。

　　测定不同条件下ZEN的降解率，所有试验重复3次，ZEN的脱除效率E（%）通过公式计算：

　　式中，Zi——反应溶液中ZEN的初始质量浓度（μg/mL）；Zf——反应溶液ZEN的最终质量浓度（μg/mL）。

　　利用HPLC-FL测定样品中ZEN含量，色谱条件：色谱柱为AgilentZorbaxEclipsePlusC18柱，柱长100mm×4.6mm。

　　流动相：乙腈∶甲醇∶水（46∶46∶8，V/V）；流动相流速：1mL/min；进样量：10μL，柱温：35℃；运行时间：7min。

　　荧光检测器的激发波长：270nm，发射波长：455nm，ZEN测定的验证参数为线性度、分析曲线、相关系数、检测限（LD）、定量限（LQ）和精度。

　　固定化酶的可重复使用性为考察固定化酶的可重复性，对酶活性进行7次重复测定。

　　每次借助外部磁铁得到固定化酶，然后用去离子水和磷酸盐缓冲液（100mmol/L，pH7.0）洗涤3次，以去除反应中留下的溶液，根据上述最佳方法测量酶活性。

　　«——【·酶学性质分析·】——»

　　由实验结果得出游离酶的最适温度为30℃，经固定化后温度转移到35℃，酶是一种蛋白质，高温可导致酶失活。

　　当温度超过30℃时，游离HRP的活性急剧下降，而固定化HRP的活性则缓慢下降。

　　固定化HRP的最适温度较游离酶高，主要是由于酶与磁性载体共价结合后，降低了HRP分子的运动活性，以及构象的自由变化[36]，因此固定化酶比游离酶具有更好的热稳定性。

　　当酸性或碱性过强时，游离酶和固定化酶的相对活性降低，在pH值为6.5和7.0时，游离酶和固定化酶表现出最大的催化活性。

　　与pH值为6.5和7.0相比，pH值为8时，游离HRP和固定HRP的最大活性分别显著降低了约30%和10%。

　　酶在磁性载体上固定后，固定化HRP在更宽的pH值范围内表现出更高的酶活性，这是因为固定化酶对酶的构象有一定限制，从而保护了酶的空间结构。

　　反应温度对玉米赤霉烯酮降解率的影响模型溶液中固定化酶添加量为0.6U/mL，过氧化氢浓度为26mmol/L，溶液pH值为7.0。

　　反应时间为480min的条件下，ZEN降解率随着温度的升高呈先升高后降低的趋势，当温度在25~35℃时，ZEN降解率随着温度的升高而增大。

　　这是因为温度升高使得自由能水平增加而导致反应活化能降低，从而增大降解效率，当温度为35℃时，降解率最高为64.35%。

　　当温度超过35℃后，随着反应温度的升高，ZEN的降解率反而下降，这是由于温度过高导致酶部分发生变性，因此选择模型溶液温度为35℃。

　　过氧化氢浓度对玉米赤霉烯酮降解率的影响模型溶液中固定化酶添加量为0.6U/mL。

　　反应温度为35℃，溶液pH值为7.0，反应时间为480min的条件下，过氧化氢浓度对ZEN降解率，随着过氧化氢浓度的增加，ZEN降解率呈先升高后降低的趋势。

　　当过氧化氢浓度为26mmol/L时，ZEN降解率最高为65.67%，当过氧化氢浓度超过26mmol/L后，ZEN降解率逐渐下降。

　　过氧化氢促使酶促反应过程中产生过氧化物酶中间体，然而当过氧化氢浓度过高时，过氧化氢可以通过氧化或破坏HRP的天然构象而使酶失去活性，因此模型溶液中过氧化氢最佳浓度为26mmol/L。

　　溶液pH值对玉米赤霉烯酮降解率的影响模型溶液中固定化酶添加量为0.6U/mL，反应温度为35℃，过氧化氢浓度为26mmol/L。

　　反应时间为480min的条件下，ZEN的降解效率随溶液pH值的变化趋势为先快速升高后趋于平稳，当pH值小于7.0时，ZEN降解率随溶液pH值的增加而显著升高。

　　当溶液pH值为7.0时，ZEN的降解率最高为63.96%，随溶液pH值继续增加，ZEN降解率趋于稳定，并没有显著变化。

　　造成这种现象的原因可能是由于pH值的变化会影响酶的相对活性和酶活性中心氨基酸链的电离形式，继续增加pH值会导致固定化酶的活性降低，因此模型溶液的最佳pH值为7.0。

　　反应时间对玉米赤霉烯酮降解率的影响模型溶液中固定化酶添加量为0.6U/mL，反应温度为35℃，过氧化氢浓度为26mmol/L。

　　溶液pH值为7.0的条件下，当反应时间小于480min时，随着反应时间的延长，ZEN降解率呈逐渐升高的趋势。

　　在480min后降解率最高为67.37%，磁性固定化HRP与ZEN几乎达到完全反应，随着反应时间持续延长，酶解反应达到平衡，ZEN降解率的变化较小。

　　降解率趋于平衡可能是由于反应产物对酶反应产生抑制或部分酶发生失活，继续增大反应时间并不能取得更好的结果，因此固定化HRP降解ZEN的最佳时间为480min。

　　固定化酶可以通过施加外部磁场使其很容易的从反应溶液中分离，酶的相对活性随使用次数增加呈下降趋势。

　　重复使用5次后，HRP的相对活性仍保持了79.85%的催化活性，酶活性减少的原因可能是由于酶经过反复洗涤，不可避免的导致了酶从载体上部分脱落。

　　此外酶的活性中心附近反应产物的增加，也会导致酶活性降低。由此可知，HRP经过固定化后，具有良好的重复使用性。

　　液相色谱分离谱图采用高效液相色谱法对反应溶液进行分析，ZEN标准溶液质量浓度为2μg/mL时的色谱图，ZEN的出峰时间为1.2min。

　　经固定化HRP酶解后，ZEN的含量明显下降，并在1.0min附近出现了新的峰。

　　结果表明，在过氧化氢的存在下，过氧化物酶可以有效催化ZEN的降解。由于ZEN的检测和定量浓度较低。

　　为了确保精确的结果，使用的高效液相色谱结合荧光检测器检测ZEN定量方法的验证。

　　结果表明，曲线方程的相关系数R2为0.9982，其值可用于微量元素的分析，也就证明该方法可以可靠地用于监测模型溶液中HRP对ZEN的降解作用。

　　«——【·结论·】——»

　　本试验提供了一种降低ZEN的方法，将游离HRP共价固定在磁性复合载体Fe3O4-SiO2-HPGCOOH上。

　　酶与磁性载体结合后，平均粒径为纳米级，呈现超顺磁性，固定化酶的pH耐受性和热稳定性均高于游离酶。

　　ZEN降解试验表明在固定化酶浓度为0.6U/mL，反应温度为35℃，过氧化氢浓度为26mmol/L，溶液pH值为7.0，反应时间为480min的最优条件下。

　　ZEN降解效率为68%，高效液相色谱显示经磁性固定化HRP处理后模型溶液ZEN含量明显降低，磁性固定化HRP具有良好的重复使用性。

　　经5次循环后，固定化HRP的相对活性仍较高，研究表明磁性固定化HRP可实现对模型溶液中ZEN的有效降解。

　　«——【·参考文献·】——»

　　[1] 降低大米中磁性杂质技术研究及应用[J]. 徐金勇;李维强.粮食加工,2021

　　[2] 磁性壳聚糖微球在食品工业中的应用研究进展[J]. 范松林;任勤;张佳欣;梁欣泉.食品工业,2017

　　[3] 细纱磁性大铁辊测磁仪相关分析的探讨[J]. 袁保昌.北京纺织,1982

　　[4] 免疫磁性壳聚糖微球的制备及对阪崎肠杆菌的分离效果[J]. 朱英莲;徐莹;汪东风.中国食品学报,2016

　　[5] 基于磁性分子印迹联用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱测定海产品中的三丁基锡[J]. 杨华;徐晓兵;刘丽君;戚向阳;潘道东.食品工业科技,2016

　　作者:谈史录