人工养殖大鲵的过程中，甘草提取物是如何降低大鲵病害风险的？

　　文丨煜捷史馆

　　编辑丨煜捷史馆

　　近年来，人们积极探索可替代抗生素和化学药物的绿色天然药物，中医药农业成为研究的热点领域，中草药在水产养殖中的作用日益显著。

　　甘草是一种常见的中草药，在临床上具有多种功效，能够增强机体的非特异性免疫力。

　　而机体的非特异性免疫系统是抵御外来病原入侵的第一道防线，能够对抗各种病原体的侵袭。

　　免疫细胞，如单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、粒细胞等，以及免疫分子，如溶菌酶、补体、C-反应蛋白等，在机体的抗病过程中扮演着重要的角色。

　　因此，提取甘草的有效成分并将其制成药物，在养殖过程中进行合理应用，可能有效降低动物发病率。

　　接下来，大家便跟着煜捷一起看看：人工养殖大鲵的过程中，甘草提取物是如何降低病害风险的？

　　大鲵饲养的病症及病原

　　中国大鲵属于两栖纲中的有尾目，它也被称为娃娃鱼或孩儿鱼。

　　大鲵是我国的二级重点保护珍稀水生物种和濒危野生动植物国际贸易公约附录Ⅰ物种之一。

　　为了保护这一濒危物种，防止其种群减少导致野生资源匮乏，我国在20世纪80年代出台了一系列相关政策，鼓励人工养殖大鲵，从而使大鲵养殖业蓬勃发展。

　　可随着养殖业的发展，大鲵养殖过程中也伴随着疾病问题的出现，给养殖者带来了经济损失。

　　在大鲵疾病研究方面，国内外的主要关注点集中在大鲵病原及其引发的病症。

　　不同的病原体可以引发不同的症状，从症状上可以初步判断病原体的类型，但有时不同的病原体也可能引发相似的症状。

　　例如一些病毒和细菌都可能导致大鲵肌肉或组织出血，因此需要运用病理学、分子生物学等多种手段来进行准确的诊断。

　　机体的神经、内分泌和血液循环系统之间存在紧密的联系，它们分别产生效应物质以传递信号，从而引发一系列级联反应，而长期的应激反应也可能导致机体免疫力下降，从而引发疾病。

　　因此如果能够找到一种药物，它对血液免疫细胞具有激活作用并能有效抑制应激反应，那将显著降低大鲵发病的风险。

　　那么，甘草提取物的应用，是如何降低大鲵发病风险的呢？

　　甘草提取物

　　甘草多糖和甙类化合物的粗提取采用了水提醇沉法，简而言之，甘草饮片被置于10倍量的95％酒精中，进行60℃回流醇洗以去除杂质，随后，酒精废液在60℃下旋转蒸发并进行回收。

　　药渣经过蒸馏水浸提、过滤，废弃药渣，水提液随后与乙醇混合，以4000r/min的速度进行离心沉淀20分钟，然后舍弃上清，接着，将离心后的浸膏蒸干，研磨成粉末，并在4℃下保存。

　　甘草的粗提取粉末按0.5%和2%的质量比例与基础粉料混合，制成颗粒饵料。

　　基础粉料的成分（以干物质计）包括：鱼粉30%、鱼油10%、豆粕20%、淀粉20%、麸皮15%、无机盐预混料4.5%、维生素预混料0.5%。

　　同一批次的大鲵被随机分配到6个水泥池中，每个池的容积约为300升，每个池内饲养50尾大鲵，并使用隔板隔离，以进行平行实验。

　　在血液学实验和皮质醇实验中，我们使用了3个池，分为对照组、低剂量组和高剂量组，且采取了不同的光照处理方式。

　　血液学实验池都进行了避光处理，而皮质醇实验池则置于日光下，使大鲵面临光照胁迫。

　　对于对照组、低剂量组和高剂量组，血液学实验和皮质醇实验中的投喂方式也有所不同，对照组均接受了无药饵料，低剂量组则接受了0.5%甘草饵料，而高剂量组则接受了2%甘草饵料。

　　在实验的不同时间点（第14天、第28天、第35天、第42天和第56天）进行采样，每次从每个池中抽取10尾大鲵。

　　在进行实验之前，我们也进行了对照组的采样。采样时，我们使用一次性医用注射器从尾静脉抽取血液样本。

　　我们采用了Ainsworth方法，稍作修改，我们制备了0.5%盐水中的嗜水气单胞菌悬液，并将其浓度调整为106 CFU/mL。

　　我们取50µL血清加入等量的菌悬液中，将混合液孵育在22℃下5小时，随后按倍数稀释，取不同稀释度的样本各10µL加入到TSB培养基上，在28℃下孵育过夜，最后计算平皿上的菌落数（Colony Forming Units，CFUs）。

　　为了作为阳性对照，我们用50µL盐水代替50µL血清加入等量的菌悬液。

　　最终结果以杀菌百分率表示，计算公式为：杀菌百分率（Percentage Killing）＝（1 - 实验组CFUs / 阳性对照CFUs）×100％。

　　最后，我们还进行了淋巴细胞计数，将抗凝血使用的Giemsa染液稀释30倍，然后在血球计数板上取1滴样本，在显微镜下统计淋巴细胞的数量，并将结果转化为每毫升血液中的淋巴细胞总数。

　　将抗凝血剂注入压积管中，将其水平放置远离心脏，以每分钟2000转速离心30分钟，然后取出压积管，用标尺测量红细胞压积长度占总长度的百分比，这即为红细胞压积值。

　　将抗凝血剂以每分钟600转速离心10分钟，分离出白细胞层，然后将其浓度调整至每毫升105个备用，使用RPMI1640细胞培养液。

　　在实验中使用嗜水气单胞菌菌株，通过在显微镜下计数每100个白细胞中吞噬细菌的白细胞数量，可以计算吞噬百分率，其计算公式为：吞噬百分率 =（吞噬细菌的白细胞数/100）×100％。

　　药物组的血液白细胞吞噬活性均高于同期对照组。具体来说，高剂量组在第35天和第42天的两次结果均显著高于对照组（P <0.05），分别为（65.9±9.5）%和（66.9±8.1）%。

　　药物组和对照组的皮质醇水平有轻微波动，低剂量组的后三次测量略高于对照组，但差异不显著。

　　高剂量组的曲线始终位于对照组和低剂量组之下，每次采样期都是同期的最低值。

　　具体而言，在第28天，高剂量组的皮质醇浓度为（173.5±25.2）ng/mL，显著低于对照组的（235.7±24.8）ng/mL（P<0.05）。

　　那么从这些数据对照中，我们能够得出怎样的结论呢？

　　甘草对大鲵饲养的影响

　　血液在动物体内循环中占据着至关重要的地位，它负责将养分和氧气输送至全身，同时构成了天然的病原体入侵屏障，也能反映机体的生理特征及对环境变化的反应。

　　血液学参数对于评估机体健康、营养状态和应激反应程度至关重要，血清是血液自然沉淀后形成的上清液，内含多种免疫因子。

　　如溶菌酶、补体、碱性磷酸酶、血清蛋白、超氧化物歧化酶等，它们在抵抗外来入侵病原体方面扮演重要角色。

　　在各个采样时间点，药物组的血清杀菌活性均高于对照组，尤其是在14天和56天时，高剂量组的杀菌活性显著高于同期对照组（P<0.05），这表明甘草提取物的投喂对大鲵的血清杀菌活性有明显的增强作用。

　　由于血清中含有多种免疫因子，因此杀菌活性是综合效应，可能是激活了其中一种或多种免疫因子。

　　已有实验显示，甘草能提高尖吻鲈（Lates calcarifer）幼鱼的血清过氧化氢酶（CAT）活性和血清溶菌酶（LZM）含量（P<0.05），从而增强了尖吻鲈幼鱼的免疫力，在低温胁迫下提高了存活率。

　　一些研究学者还发现甘草具备显著的抗菌属性，对金黄色葡萄球菌等病原体都有杀菌作用，这种抗菌效应可能是由甘草中多糖、皂苷、生物碱、蒽、精油、有机酸等有效成分引起的。

　　血液中包括血清、红细胞、白细胞和血小板，红细胞承担氧气输送和养分运输的功能，其数量反映了机体的营养健康水平，白细胞则包括淋巴细胞和各种粒细胞，它们参与免疫应答，因此白细胞的数量和活性直接关系到机体的免疫反应水平。

　　血小板的主要作用是促使止血过程发生，在本实验中，56天时，低剂量组的淋巴细胞总数为（48.4±6.1）×106 个，显著高于对照组的（28.9±7.1）×106 个（P<0.05）。

　　而在35天时，高剂量组为（47.2±7.7）×106 个，也显著高于对照组的（26.4±7.3）×106 个（P<0.05）。这表明甘草有效促进了淋巴细胞的增加。

　　药物组和对照组在红细胞比容值方面没有显著差异，这些组随时间的变化不大，这可能是由于实验动物和实验方法的差异导致了不一致的结果。

　　除了白细胞数量之外，白细胞的活性，特别是吞噬活性，也是反映机体免疫应答水平的重要参数，因为它们能够吞噬机体内的老化或死亡细胞以及大量的病原微生物。

　　药物组的血液白细胞吞噬活性高于同期对照组，尤其是高剂量组在35天和42天的结果明显高于对照组（P<0.05），分别达到（65.9±9.5）%和（66.9±8.1）%，这表明甘草能够促进白细胞的吞噬活性，从而增强了对入侵病原体的防御效力。

　　至于大鲵的生活环境，最适宜的条件是避光和宁静，在皮质醇实验中，大鲵被长期置于光照下，导致其处于持续胁迫状态，随后，检测其血液皮质醇水平，以评估其对环境胁迫的反应。

　　这个实验的理论基础在于环境胁迫与生物体内分泌系统之间存在广泛的联系，在这种联系中，生物体的丘脑下部－垂体－肾间组织轴（HPI轴）起着主导作用，当生物体受到胁迫时，会触发一系列级联反应，最终导致肾间组织释放出皮质醇，释放到血液中。

　　血液中的皮质醇水平被认为是生物体应对应激的敏感信号，短期内皮质醇水平上升是生物体的正常生理反应，对其有益。

　　如果皮质醇长时间保持高水平，可能会对生物体产生不良影响，包括免疫力下降、生长发育受阻、内分泌紊乱以及对病原体更加敏感等问题。

　　高剂量组的皮质醇曲线显示明显低于对照组和低剂量组，每次采样期都呈现出最低水平。这结果表明高剂量甘草的应用有效地抑制了大鲵在受到胁迫后血液皮质醇水平的升高。

　　类似地，研究还发现，在亚硝酸盐胁迫下，通过添加发酵甘草的饵料喂养斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）后，鱼体血液中的皮质醇含量明显低于对照组。

　　这结果表明，饵料中添加发酵甘草能够有效地减轻石斑鱼的应激反应。

　　甘草表现出了在促进大鲵的血液杀菌活性和白细胞吞噬活性方面的良好效果，显示其在免疫调控方面具有潜在的促进作用。

　　此外，甘草还有效减轻了大鲵在胁迫下的应激反应，为其作为抗应激剂的潜在用途提供了证据。

　　不过中草药在水产养殖中的应用方面，仍然存在一些实际问题需要解决，以明确哪些成分起到关键作用以及其内在机制。

　　最后，考虑到中草药的产地、品种、采摘季节、入药部位以及提取方法等因素的差异，这些因素可能会极大地影响实验结果，因此在引用和比较时应格外注意考虑这些因素。

　　作者:煜捷史馆